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crecimiento y produccion de compuestos secundarios en hojas de matico(piper aduncum L.)cultivadas bajo luz ambiental alterada

crecimiento y produccion de compuestos secundarios en hojas de matico(piper aduncum L.)cultivadas bajo luz ambiental alterada

Compuestos secundarios en hojas de Matico cultivadas bajo luz ambiental alterada.

Abstracto

La especie Piper aduncum L. nativa de las Américas, tiene importantes beneficios biológicos para la producción de compuestos secundarios como los fenólicos y los flavonoides. Entre los factores que influyen en el metabolismo de la planta, la luz se considera uno de los más importantes para promover cambios en la fisiología de la planta que pueden interferir directamente en el crecimiento y la producción de compuestos secundarios.

Este estudio tuvo como objetivo evaluar el crecimiento y la producción de diferentes compuestos secundarios (ácidos fenólicos totales, flavonoides, lignina y actividad de la fenilalanina amoníaco-liasa – PAL) de Piper aduncum L. Los tratamientos fueron: cuatro invernaderos de protección contra la luz (luces ambientales modificadas), con 50%, 70% de la irradiancia natural, mallas rojas y azules, y una a pleno sol (100% de la irradiancia natural), con 20 réplicas por tratamiento.

crecimiento y producción

El crecimiento de Piper aduncum se vio afectado por la diferente luz ambiental alterada, mostrando un mayor crecimiento bajo la malla azul. Sin embargo, la especie muestra respuestas que permiten su supervivencia a pleno sol, como una mayor producción de raíces. La producción de compuesto secundario también se vio afectada por la luz, y la producción de compuestos fenólicos y de lignina más alta (respectivamente 0.18 y 11.7 µg g DM-1 ) en el tratamiento de invernadero de malla azul. Además, la PAL puede considerarse la enzima clave para la producción de compuestos fenólicos en esta especie.

La concentración de flavonoides en el tratamiento con 100% de irradiancia fue la más baja. Esto demuestra que la especie tiene otro mecanismo de protección para irradiancia alta.

Abreviaturas: DAT – Days After Transplant (días después del trasplante); PAL – Phenylananine Ammonia Liase (fenilalanina amoníaco-liasa); LDM – Leaf Dry Mass (masa seca de la hoja); SDM – Steam Dry Mass (masa seca del tallo); RDM- Roots Dry Mass (masa seca de las raíces); TDM – Total Dry Mass (masa seca total); SLA – Specific Leaf Area (área foliar específica); LAR – Leaf Area Ratio (cociente del área foliar); RWR -root weight ratio (cociente del peso de la raíz); RN – Red Net (malla roja); BN – Blue Net (malla azul).

planta matico
Este tipo de planta (Piper aduncum)cuenta con un buen metabolismo teniendo beneficios biológicos como los fenólicos y los flavonoides.

Introducción

Piper aduncum (Piperaceae) es un arbusto nativo de las Américas, y que tiene potencial para uso comercial (Rocha et al., 2008). Produce aceites esenciales con un alto rendimiento (2.5 a 3.5%), tiene baja toxicidad y es rico en dillapiole (31.5 a 91.1%) (Maia et al., 1998; Sousa et al., 2008).

Piper aduncum

Este compuesto presenta propiedades antimicrobianas y actúa como insecticida y molusquicida (Orjala et al, 1994; Fazolin et al., 2005; Lara-Junior et al., 2012; Misni et al, 2011). Sin embargo, según Bernard et al. (1995) el género Piper todavía puede producir muchos tipos de metabolitos secundarios, tales como los fenilpropanoides, los flavonoides y los lignoides, que pueden ser explotados por la industria química y farmacéutica. Sin embargo, la producción y la calidad de los compuestos secundarios se modifican por varios factores ambientales. La intensidad y la calidad de la luz son factores ambientales importantes que alteran la síntesis de estos compuestos porque afecta la morfología y los procesos fisiológicos de las plantas. La biosíntesis de los flavonoides y otros ácidos fenólicos, por ejemplo, necesitan cantidades más grandes de irradiancia, o se incrementan en estas condiciones (Ghasemzadeh y Ghasemzadeh, 2011).

Estudios previos muestran que los cambios en la intensidad y la calidad de la luz provocan un aumento en la producción de flavonoides y fenólicos totales en plantas medicinales (Ghasemzadeh et al., 2010; Karimi et al., 2013). Por lo tanto, en el cultivo de plantas medicinales, el manejo del microclima podría ser una alternativa prometedora para el control de los niveles fitoquímicos y la calidad del material vegetal.

luz para el aumento de flavonoides

El control y la uniformidad de la luz pueden resultar en un aumento en el crecimiento, una mejor planificación de la producción y un mayor control de la contaminación o el ataque de insectos (Karimi et al., 2013). Sin embargo, la existencia de diferencias interespecíficas en el microambiente puede influir en la acumulación de plantas y la distribución de los fenólicos y flavonoides totales (Jaafar y Rahmat, 2008). Los compuestos de flavonoides y de fenólicos son importantes para las plantas, frente a la luz UV y protegen a las especies de oxígeno reactivas. Una fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) es una enzima involucrada en su biosíntesis. La actividad de la PAL es regulada por muchos factores, como la edad, la herbivoría y mayormente las condiciones de luz (KUMARI et al., 2009; NAWKAR et al., 2013). Los estudios realizados con Kalanchoe pinnata mostraron un aumento en la produccion.

 Piper aduncum
El Piper aduncum es un arbusto que produce aceites esenciales con un alto rendimiento.

Resultados y discusión

Relaciones de crecimiento

El crecimiento de Piper aduncum se vio afectado por diferentes tratamientos de irradiancia (Fig. 1). Las plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules presentaron el mayor crecimiento en altura y diámetro del tallo en todo el experimento (Fig. 1A, 1B). Se observaron resultados similares para Ocimum selloi, Mikania glomerata y Mikania laevigata, que mostraron la mejor altura en los tratamientos con mallas rojas y azules (Souza et al., 2007; Costa et al., 2010). El área foliar total fue mayor en las plantas que crecieron bajo mallas azules y rojas (Fig. 1D).

El aumento en el área foliar bajo las mallas fotoselectivas puede considerarse un medio para que la planta aumente la superficie fotosintética, con un mayor uso de bajas intensidades de luz y, por lo tanto, compensando las tasas de fotosíntesis por unidad de área, la cual es una característica de las hojas adaptadas a la sombra (Jones and McLeod, 1991). Oliveira (2009) obtuvo resultados similares con la especie Artemisia vulgaris, que presentó un área foliar más grande bajo mallas rojas y azules, en comparación con las irradiancias de 50% y 100%. Las plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules, donde las proporciones de la gama de color rojo y azul son alteradas y se bloquea la intensidad de radiación, presentaron los promedios más altos de área foliar.

porsentaje de Piper aduncum

El área foliar más pequeña se observó en el tratamiento con 50% y 70% de irradiancia. Este resultado indica que la calidad de la luz es un factor decisivo para la expansión de la lámina de la hoja en matico. El número de hojas fue mayor en plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules, con una irradiancia del 70% y 100%. En los tratamientos con 100% y 70%, se observó una reducción en el área foliar, pero aumentaron el número de hojas. Se observaron respuestas similares en Ocimum gratissimum, donde los altos niveles de irradiancia proporcionaron una disminución en el área foliar y un aumento en el número de hojas (Fernandes et al., 2013). La masa seca de la hoja y la masa seca del tallo fueron mayores en los tratamientos con 50% y 100% de irradiancia y, tanto RN como BN (Fig. 2).

control de radiación para el crecimiento

Este resultado muestra la importancia de la intensidad y la calidad de la radiación para el crecimiento de las plantas, no solo para el suministro de energía para la fotosíntesis, sino también para generar signos que regulan su desarrollo. La LWR fue mayor en el tratamiento con 100% y 50% de irradiancia y menor bajo mallas rojas. La RWR fue mayor en las plantas cultivadas con 100% y 70% de irradiancia y bajo mallas rojas (Tabla 1). El área foliar más grande y la masa seca total encontrada en las plantas cultivadas bajo mallas azules evidencia que el aumento en el área foliar permitió una mayor intercepción de luz, favoreciendo la producción de fotoasimilados . El cociente de las R/AP fue mayor en plantas cultivadas con 100%, 70% de irradiancia y bajo mallas rojas, la cual fue menor en tratamientos con mallas azules y 50% de irradiancia (Tabla 1).

Además, la reducción en el grosor de las hojas en las plantas que crecen bajo sombra se debe a la diferencia en la distribución y en el consumo de fotoasimilados para la expansión de las hojas, especialmente en plantas cultivadas bajo mallas azules, que presentaron hojas con un área foliar más grande y un LAR más grande. En Ocimum selloi, también se verificó una reducción en el grosor de la hoja, cuando la planta fue cultivada bajo mallas azules (Costa et al., 2010).

Tales resultados nos permiten implementar el cultivo de plantas medicinales, con mayor control de producción, ya que existen pocos estudios con cultivos en ambientes protegidos. Conociendo las respuestas de crecimiento, a medida que dirigimos el entorno de crecimiento para aumentar la producción de compuestos secundarios y biomasa

Esta planta tiene diferentes tratamientos dependiendo la irradiancia del sol.

Actividad Fenólica y PAL

La irradiancia también presentó un efecto sobre la producción de fenólicos totales (Fig. 3). El contenido de ácidos fenólicos y lignina fue mayor en el tratamiento con mallas azules y menor en el tratamiento con mallas rojas y 100% de irradiancia (Figs. 4A, 4B). Tal resultado indica que los compuestos secundarios están influenciados por la calidad y la cantidad de irradiancia. Los estudios realizados con Protea cynaroides L., cultivado in vitro, mostraron que también presentaba una mayor concentración de fenólicos totales cuando se cultivaban bajo luz azul (LED) y una cantidad menor bajo luz roja (Wu y Lin, 2012). Sin embargo, el jengibre (Zingiber officinale Roscoe) cultivado con diferentes intensidades de luz natural presentó resultados diferentes, donde las altas irradiancias causaron un aumento en estos compuestos (Ghasemzadeh et al., 2010).

El aumento del contenido de lignina en plantas cultivadas(Piper aduncum) bajo mallas azules puede ser una respuesta a cambios anatómicos, generalmente inducidos en condiciones adversas que proporcionan la protección de las células (Ghasemzadeh et al., 2010). Por lo tanto, la mayor producción de fenólicos y lignina totales se puede relacionar con una mayor resistencia en las plantas (Martti et al., 2004). El aumento en los compuestos fenólicos totales por el tratamiento con mallas azules puede ser beneficioso para las plantas en el combate de enfermedades o el ataque de herbívoros en Piper aduncum. Además, la síntesis de estos compuestos está aparentemente influenciada por la calidad de la luz. El contenido de flavonoides fue menor en el tratamiento con 100% de irradiancia y no se observaron diferencias significativas en los otros tratamientos (Fig. 4C). Este resultado indica la alta influencia de las intensidades de irradiancia en la producción de flavonoides.

Ghasemzadeh y Ghasemzadeh (2011) observaron que las hojas de Zingiber officinale Roscoe presentaron un mayor contenido de flavonoides cuando fueron expuestas a la sombra. Los flavonoides son conocidos como sustancias protectoras contra el daño inducido por el exceso de luz y como antioxidantes (Jaakola et al., 2004; Nascimento et al., 2013).

beneficio del crecimiento de Piper aduncum

El crecimiento de Piper aduncum a 100% de irradiancia no fue beneficioso para la estimulación de estas defensas, o esta especie todavía presenta otros mecanismos de protección contra las altas irradiancias. Pacheco et al. (2013) observó en condiciones de pleno sol, un aumento de carotenoides. Por lo tanto, estos pigmentos pueden ser asociados con mecanismos de fotoprotección para esta especie. La actividad de la PAL aumentó en los tratamientos con 50% y 70% de irradiancia y mallas azules (Fig. 4D). la producción de fotoasimilados del metabolismo primario puede causar un aumento en las concentraciones de compuestos fenólicos a altas irradiancias (Warren et al., 2003). Sin embargo, cuando la luz, el agua y los nutrientes son suficientes; el crecimiento y la adaptación de la planta son priorizados. Por lo tanto, una alta cantidad de fenilalanina es utilizada para la síntesis de proteínas, y en consecuencia disminuye la producción de compuestos fenólicos.

La síntesis más baja de compuestos secundarios observada en las plantas cultivadas con 100% de irradiancia, está relacionada con la inducción de una tensión que fuerza su adaptación bajo estas condiciones. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar el aumento en la producción de metabolitos secundarios, debido a la disminución en la producción de metabolitos primarios a través de la fotosíntesis o la tensión inducida por las condiciones de irradiancia (Ghasemzadeh y Ghasemzadeh, 2011).

malla sombra azul
Usar malla sombra azul trae mas beneficios que usar una malla sombra roja.

Materiales y métodos

Localidad y material vegetal.

El experimento se realizó en la Universidad Federal de Lavras, Brasil. Las plántulas de Piper aduncum se produjeron en el Departamento de Biología, a partir de semillas. Las semillas fueron previamente germinadas en placas de Petri, en tres hojas de papel de filtro y se mantuvieron en una cámara de germinación de Mangelsdorf, a 25°C y durante un fotoperíodo de 12 horas, durante 30 días. Después de este período, las plántulas fueron transferidas a bandejas de polipropileno que contenían el sustrato comercial Tropstrato HA® (Vida Verde©, Brasil) y se mantuvieron en invernaderos con un 50% de sombreado hasta que alcanzaron los 2,5 cm de altura. Las plantas destinadas al cultivo a pleno sol (100% de irradiancia) se aclimataron previamente durante 7 días a 70% de irradiancia y luego durante 7 días a pleno sol antes de ser trasplantadas al sustrato definitivo.

localidad y clima

La irrigación se realizó diariamente y el suelo se mantuvo bajo la condición de capacidad de campo. Después de la aclimatación, las plántulas se trasplantaron a macetas de plástico, con una capacidad de 6 litros, que contenían un sustrato compuesto de subsuelo, arena y estiércol bovino, en proporción de 2: 1: 1, que se dispuso en los diferentes tratamientos de irradiancia. El experimento se realizó entre abril y julio de 2012, en la granja Gota da Esperança, perteneciente al Departamento de Agricultura, con las siguientes coordenadas geográficas: 21°14’07″S y 44°58’22″W, a 879 m de altitud. Las condiciones climáticas promedio observadas durante el experimento fueron proporcionadas por la Estación Climatológica del Departamento de Ingeniería Agrícola, tenían una temperatura máxima de 30.2°C y una mínima de 6.3°C, una precipitación de 1.28 mm y una humedad relativa de 72.7%.

piper aduncum
Se realizaron varios experimento en la universidad federal Lavras de brasil con la semilla de esta especie y obtuvieron varios resultados.

Luz ambiental alterada

Los tratamientos se caracterizaron por el cultivo de plantas durante 120 días, bajo cuatro luces ambientales alteradas, producidas por invernaderos de sombra con 70% y 50% de irradiancia natural incidente, dos mallas de sombreo de colores , en rojo (RN) y azul (BN), bloqueando el 50% de la radiación incidente y un tratamiento a pleno sol. Con la ayuda de un espectrorradiómetro portátil (USB650 Red Tide) acoplado a una fuente de radiación electromagnética DT-MINI (200 a 2000 nm) y una sonda reflectante R400-7-VIS-NIR (US BioSolutions Ocean Optics®), el espectro de radiación de diferentes ambientes fue evaluado, con una resolución espectral de 1 nm.

Las irradiancias normalizadas observadas en el tratamiento de 50% fueron 6.54 W/m², 13.08 W/m² en el tratamiento de 70%, 15.42 W/m² de 100%, 8.86 W/m² en BN y 9.07 W/m² en BN. Cada ambiente presentó los valores más altos en términos de cantidad y tamaño del espectro para la atmósfera con 100% de irradiancia, seguido de la atmósfera de la RN, en la que el valor encontrado fue de 70%, y 50% de irradiancia para el medio ambiente con BN. También se observó que la malla azul proporcionaba irradiancias, de aproximadamente 450-550 nm, y la malla roja entre 490 y 690 nm.

Análisis de crecimiento

El crecimiento se evaluó en veinte plantas de cada tratamiento y se tomaron como base las siguientes variables morfológicas: altura, diámetro del tallo, área foliar (LA), número de hojas, masa seca de la hoja (LDM), masa seca del tallo (SDM), masa seca de la raíz (RDM) y masa seca total (TDM).

También se calcularon los siguientes cocientes: raíz/partes aéreas (R/AP = RDM/ (LDM + TDM)), área foliar específica (SLA = LA/LDM), cociente del área foliar (LAR = LA/TDM), cociente del peso de la hoja (LWR = LDM/TDM) y cociente del peso de la raíz (RWR = RDM/TDM), utilizando ecuaciones de acuerdo con Benincasa (2003). La altura, el diámetro del tallo, el número de hojas y el área foliar se midieron en 15 días. La altura se midió con una escala graduada, una precisión de 1,0 mm y se midieron las distancias desde la superficie del suelo hasta la parte superior. El diámetro del tallo se midió con precisión con un calibre digital de 0,01 mm en la superficie del suelo.

Las variables masa seca de la hoja, masa seca del tallo, masa seca de la raíz y masa seca total se obtuvieron al final del período experimental (120 días). La masa seca se obtuvo al secar las hojas; El tallo y las raíces, previamente separados, se secaron en un horno de aire forzado, a 70°C, a peso constante.

hoja de matico
Tuvo un excelente crecimiento base a su desarrollo.

Metabolitos secundarios

Los compuestos secundarios se analizaron 150 días después del trasplante y se cuantificaron los contenidos de compuestos fenólicos totales, lignina y flavonoides. Además, también se verificó la actividad de la fenilalanina amoníaco-liasa (PAL). Se recolectaron dos hojas, completamente expandidas, ubicadas entre el segundo y tercer nudo de cinco plantas para cada tratamiento;

Los análisis de composición se realizaron por triplicado. Los contenidos de ácidos fenólicos totales y lignina se determinaron de acuerdo con Zieslin y Ben-Zaken (1993) con modificaciones. Para la extracción, los tejidos se trituraron con nitrógeno líquido y luego se liofilizaron durante seis horas. El material liofilizado se pesó (30 mg) y se transfirió a un tubo de 2-ml, se agregaron 1.5 ml de metanol al 80% y se mantuvo bajo agitación durante 15 horas a temperatura ambiente y en la oscuridad. El extracto se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min;

El sobrenadante se utilizó para la cuantificación de fenólicos totales y el precipitado para la extracción de lignina. Para la cuantificación de los ácidos fenólicos totales, 30 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu se mezclaron con extracto de metanol (0,25 N) en una placa ELISA y se dejaron reposar durante 5 minutos. Luego, se agregaron 30 µL de carbonato sódico 1M y se homogeneizaron durante 10 minutos.

caracterización de Piper aduncum

Completó 160 µL de agua destilada, reposando durante 1 hora y se centrifugó a 2.250 x g durante 5 minutos. Luego, se recogieron 180 µL de esta mezcla y se depositaron en otra placa ELISA. Todo el procedimiento se realizó a temperatura ambiente. Las lecturas se realizaron a 725 nm. El contenido de ácidos fenólicos totales se calculó en función de la curva estándar de catecol y el valor se expresó en µg de catecol por gramo de materia seca. La lignina se extrajo del precipitado resuspendido en 1,5 ml de metanol al 80% y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó y el precipitado se secó a 65ºC durante cuatro horas. El precipitado seco se resuspendió en 1,5 ml de una solución 1:10 de ácido tioglicólico y ácido clorhídrico 2N y se homogeneizó en un baño de agua.

tiempo de lectura de Piper aduncum

Una vez más, el sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 1.5 ml de agua destilada y se sometió a centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió en 1,5 ml de hidróxido de sodio 0.5 M, se mantuvo bajo agitación durante 15 horas a temperatura ambiente y se sometió a centrifugación a 12,000g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 2-ml y se agregaron 200 µL de ácido clorhídrico concentrado; luego se mantuvo en hielo durante cuatro horas y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 2 mL de hidróxido de sodio 0.5 M y se homogeneizó. Se recogieron 200 µL del extracto y se depositaron en una placa ELISA.

resultados de la lectura

Las lecturas se realizaron a 280 nm. El contenido de lignina se calculó basándose en la curva estándar de lignina y el valor se expresó en µg de lignina por gramo de materia seca. Los flavonoides totales se extrajeron de las hojas según un método adaptado de Santos y Blatt (1998). Aproximadamente 250 mg de materia seca se mantuvieron en metanol al 70% (v/v) durante 24 horas. Se transfirió una parte alícuota de 50 µl del sobrenadante a tubos de ensayo que contenían 1.8 ml de metanol al 70%. Se transfirió una parte alícuota de 50 µl del sobrenadante a tubos de ensayo que contenían 1.8 ml de metanol al 70%. Luego, se agregaron 130 µl de una solución de cloruro de aluminio (5g de cloruro de aluminio en 100 mL de metanol al 70%) y 6,7 ml de metanol al 70%, que se agitaron vigorosamente.

planta matico
El metabolismo secundario que tuvo la planta fue que se cuantificaron sus compuestos de fenolicos y flavonoides.

Análisis estadístico de Piper aduncum

El diseño experimental fue completamente aleatorio, en el que se utilizaron 20 réplicas por tratamiento para las evaluaciones de crecimiento y 5 réplicas para análisis bioquímicos. Los datos obtenidos durante un tiempo prolongado (cuantitativo) se analizaron mediante regresión polinomial (p ≤0.05), mientras que los datos cualitativos fueron sometidos a un análisis de la varianza, y las mediciones se compararon mediante la prueba de Tukey (p ≤0.05), utilizando el programa SAEG (SAEG-2007).

Tabla 1. Cociente de las raíces/partes aéreas (R/AP), área foliar específica (SLA), cociente del área foliar (LAR), cociente del peso de la hoja (LWR) y cociente del peso de la raíz (RWR) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes condiciones de irradiancia

tabla Tukey mallas rojas y mallas azules
Altura , diámetro del tallo , número de hojas (C) y área foliar de Piper aduncum

Fig 1. Altura (A), diámetro del tallo (B), número de hojas (C) y área foliar (D) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes irradiancias (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules – BN), a 120 DAT (días después del trasplante). Lavras, Brasil.

tabla Masa seca de hoja

Fig 2. Masa seca de hoja (LDM), masa seca del tallo (SDM), masa seca de la raíz (RDM) y masa seca total (TDM) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes condiciones de irradiancia (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules –BN). Las medias seguidas por la misma letra en las columnas no difieren según la prueba de Tukey (p≤0.05). Lavras, Brasil.

tabla Ácidos fenólicos totales

Fig 3. . Ácidos fenólicos totales (A), lignina (B), flavonoides (C) y actividad de la PAL (D) en hojas de Piper aduncum L. cultivadas bajo diferentes condiciones de irradiancia (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules –BN). *Las medias seguidos por la misma letra en las columnas no difieren según la prueba de Tukey (p≤0.05) .Lavras, Brasil.

Conclusiones

El crecimiento y la síntesis de los compuestos secundarios (ácidos fenólicos totales, lignina y flavonoides) de Piper aduncum se vieron influenciados por las diferentes condiciones de irradiancia. Las plantas cultivadas bajo mallas de sombreo fotoselectivas azules presentaron un mayor crecimiento y producción de masa seca. La mayor cantidad de compuestos secundarios se obtuvo en las plantas cultivadas en mallas de sombreo azules. Por lo tanto, dado que es la especie productora con potencial comercial de compuestos bioactivos, se recomienda su cultivo en ambientes complementados con luz azul.

Compuestos secundarios en hojas de Matico cultivadas bajo luz ambiental alterada.

Abstracto

La especie Piper aduncum L. nativa de las Américas, tiene importantes beneficios biológicos para la producción de compuestos secundarios como los fenólicos y los flavonoides. Entre los factores que influyen en el metabolismo de la planta, la luz se considera uno de los más importantes para promover cambios en la fisiología de la planta que pueden interferir directamente en el crecimiento y la producción de compuestos secundarios.

Este estudio tuvo como objetivo evaluar el crecimiento y la producción de diferentes compuestos secundarios (ácidos fenólicos totales, flavonoides, lignina y actividad de la fenilalanina amoníaco-liasa – PAL) de Piper aduncum L. Los tratamientos fueron: cuatro invernaderos de protección contra la luz (luces ambientales modificadas), con 50%, 70% de la irradiancia natural, mallas rojas y azules, y una a pleno sol (100% de la irradiancia natural), con 20 réplicas por tratamiento.

crecimiento y producción

El crecimiento de Piper aduncum se vio afectado por la diferente luz ambiental alterada, mostrando un mayor crecimiento bajo la malla azul. Sin embargo, la especie muestra respuestas que permiten su supervivencia a pleno sol, como una mayor producción de raíces. La producción de compuesto secundario también se vio afectada por la luz, y la producción de compuestos fenólicos y de lignina más alta (respectivamente 0.18 y 11.7 µg g DM-1 ) en el tratamiento de invernadero de malla azul. Además, la PAL puede considerarse la enzima clave para la producción de compuestos fenólicos en esta especie.

La concentración de flavonoides en el tratamiento con 100% de irradiancia fue la más baja. Esto demuestra que la especie tiene otro mecanismo de protección para irradiancia alta.

Abreviaturas: DAT – Days After Transplant (días después del trasplante); PAL – Phenylananine Ammonia Liase (fenilalanina amoníaco-liasa); LDM – Leaf Dry Mass (masa seca de la hoja); SDM – Steam Dry Mass (masa seca del tallo); RDM- Roots Dry Mass (masa seca de las raíces); TDM – Total Dry Mass (masa seca total); SLA – Specific Leaf Area (área foliar específica); LAR – Leaf Area Ratio (cociente del área foliar); RWR -root weight ratio (cociente del peso de la raíz); RN – Red Net (malla roja); BN – Blue Net (malla azul).

planta matico
Este tipo de planta (Piper aduncum)cuenta con un buen metabolismo teniendo beneficios biológicos como los fenólicos y los flavonoides.

Introducción

Piper aduncum (Piperaceae) es un arbusto nativo de las Américas, y que tiene potencial para uso comercial (Rocha et al., 2008). Produce aceites esenciales con un alto rendimiento (2.5 a 3.5%), tiene baja toxicidad y es rico en dillapiole (31.5 a 91.1%) (Maia et al., 1998; Sousa et al., 2008).

Piper aduncum

Este compuesto presenta propiedades antimicrobianas y actúa como insecticida y molusquicida (Orjala et al, 1994; Fazolin et al., 2005; Lara-Junior et al., 2012; Misni et al, 2011). Sin embargo, según Bernard et al. (1995) el género Piper todavía puede producir muchos tipos de metabolitos secundarios, tales como los fenilpropanoides, los flavonoides y los lignoides, que pueden ser explotados por la industria química y farmacéutica. Sin embargo, la producción y la calidad de los compuestos secundarios se modifican por varios factores ambientales. La intensidad y la calidad de la luz son factores ambientales importantes que alteran la síntesis de estos compuestos porque afecta la morfología y los procesos fisiológicos de las plantas. La biosíntesis de los flavonoides y otros ácidos fenólicos, por ejemplo, necesitan cantidades más grandes de irradiancia, o se incrementan en estas condiciones (Ghasemzadeh y Ghasemzadeh, 2011).

Estudios previos muestran que los cambios en la intensidad y la calidad de la luz provocan un aumento en la producción de flavonoides y fenólicos totales en plantas medicinales (Ghasemzadeh et al., 2010; Karimi et al., 2013). Por lo tanto, en el cultivo de plantas medicinales, el manejo del microclima podría ser una alternativa prometedora para el control de los niveles fitoquímicos y la calidad del material vegetal.

luz para el aumento de flavonoides

El control y la uniformidad de la luz pueden resultar en un aumento en el crecimiento, una mejor planificación de la producción y un mayor control de la contaminación o el ataque de insectos (Karimi et al., 2013). Sin embargo, la existencia de diferencias interespecíficas en el microambiente puede influir en la acumulación de plantas y la distribución de los fenólicos y flavonoides totales (Jaafar y Rahmat, 2008). Los compuestos de flavonoides y de fenólicos son importantes para las plantas, frente a la luz UV y protegen a las especies de oxígeno reactivas. Una fenilalanina amoníaco-liasa (PAL) es una enzima involucrada en su biosíntesis. La actividad de la PAL es regulada por muchos factores, como la edad, la herbivoría y mayormente las condiciones de luz (KUMARI et al., 2009; NAWKAR et al., 2013). Los estudios realizados con Kalanchoe pinnata mostraron un aumento en la produccion.

 Piper aduncum
El Piper aduncum es un arbusto que produce aceites esenciales con un alto rendimiento.

Resultados y discusión

Relaciones de crecimiento

El crecimiento de Piper aduncum se vio afectado por diferentes tratamientos de irradiancia (Fig. 1). Las plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules presentaron el mayor crecimiento en altura y diámetro del tallo en todo el experimento (Fig. 1A, 1B). Se observaron resultados similares para Ocimum selloi, Mikania glomerata y Mikania laevigata, que mostraron la mejor altura en los tratamientos con mallas rojas y azules (Souza et al., 2007; Costa et al., 2010). El área foliar total fue mayor en las plantas que crecieron bajo mallas azules y rojas (Fig. 1D).

El aumento en el área foliar bajo las mallas fotoselectivas puede considerarse un medio para que la planta aumente la superficie fotosintética, con un mayor uso de bajas intensidades de luz y, por lo tanto, compensando las tasas de fotosíntesis por unidad de área, la cual es una característica de las hojas adaptadas a la sombra (Jones and McLeod, 1991). Oliveira (2009) obtuvo resultados similares con la especie Artemisia vulgaris, que presentó un área foliar más grande bajo mallas rojas y azules, en comparación con las irradiancias de 50% y 100%. Las plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules, donde las proporciones de la gama de color rojo y azul son alteradas y se bloquea la intensidad de radiación, presentaron los promedios más altos de área foliar.

porsentaje de Piper aduncum

El área foliar más pequeña se observó en el tratamiento con 50% y 70% de irradiancia. Este resultado indica que la calidad de la luz es un factor decisivo para la expansión de la lámina de la hoja en matico. El número de hojas fue mayor en plantas cultivadas bajo mallas rojas y azules, con una irradiancia del 70% y 100%. En los tratamientos con 100% y 70%, se observó una reducción en el área foliar, pero aumentaron el número de hojas. Se observaron respuestas similares en Ocimum gratissimum, donde los altos niveles de irradiancia proporcionaron una disminución en el área foliar y un aumento en el número de hojas (Fernandes et al., 2013). La masa seca de la hoja y la masa seca del tallo fueron mayores en los tratamientos con 50% y 100% de irradiancia y, tanto RN como BN (Fig. 2).

control de radiación para el crecimiento

Este resultado muestra la importancia de la intensidad y la calidad de la radiación para el crecimiento de las plantas, no solo para el suministro de energía para la fotosíntesis, sino también para generar signos que regulan su desarrollo. La LWR fue mayor en el tratamiento con 100% y 50% de irradiancia y menor bajo mallas rojas. La RWR fue mayor en las plantas cultivadas con 100% y 70% de irradiancia y bajo mallas rojas (Tabla 1). El área foliar más grande y la masa seca total encontrada en las plantas cultivadas bajo mallas azules evidencia que el aumento en el área foliar permitió una mayor intercepción de luz, favoreciendo la producción de fotoasimilados . El cociente de las R/AP fue mayor en plantas cultivadas con 100%, 70% de irradiancia y bajo mallas rojas, la cual fue menor en tratamientos con mallas azules y 50% de irradiancia (Tabla 1).

Además, la reducción en el grosor de las hojas en las plantas que crecen bajo sombra se debe a la diferencia en la distribución y en el consumo de fotoasimilados para la expansión de las hojas, especialmente en plantas cultivadas bajo mallas azules, que presentaron hojas con un área foliar más grande y un LAR más grande. En Ocimum selloi, también se verificó una reducción en el grosor de la hoja, cuando la planta fue cultivada bajo mallas azules (Costa et al., 2010).

Tales resultados nos permiten implementar el cultivo de plantas medicinales, con mayor control de producción, ya que existen pocos estudios con cultivos en ambientes protegidos. Conociendo las respuestas de crecimiento, a medida que dirigimos el entorno de crecimiento para aumentar la producción de compuestos secundarios y biomasa

Esta planta tiene diferentes tratamientos dependiendo la irradiancia del sol.

Actividad Fenólica y PAL

La irradiancia también presentó un efecto sobre la producción de fenólicos totales (Fig. 3). El contenido de ácidos fenólicos y lignina fue mayor en el tratamiento con mallas azules y menor en el tratamiento con mallas rojas y 100% de irradiancia (Figs. 4A, 4B). Tal resultado indica que los compuestos secundarios están influenciados por la calidad y la cantidad de irradiancia. Los estudios realizados con Protea cynaroides L., cultivado in vitro, mostraron que también presentaba una mayor concentración de fenólicos totales cuando se cultivaban bajo luz azul (LED) y una cantidad menor bajo luz roja (Wu y Lin, 2012). Sin embargo, el jengibre (Zingiber officinale Roscoe) cultivado con diferentes intensidades de luz natural presentó resultados diferentes, donde las altas irradiancias causaron un aumento en estos compuestos (Ghasemzadeh et al., 2010).

El aumento del contenido de lignina en plantas cultivadas(Piper aduncum) bajo mallas azules puede ser una respuesta a cambios anatómicos, generalmente inducidos en condiciones adversas que proporcionan la protección de las células (Ghasemzadeh et al., 2010). Por lo tanto, la mayor producción de fenólicos y lignina totales se puede relacionar con una mayor resistencia en las plantas (Martti et al., 2004). El aumento en los compuestos fenólicos totales por el tratamiento con mallas azules puede ser beneficioso para las plantas en el combate de enfermedades o el ataque de herbívoros en Piper aduncum. Además, la síntesis de estos compuestos está aparentemente influenciada por la calidad de la luz. El contenido de flavonoides fue menor en el tratamiento con 100% de irradiancia y no se observaron diferencias significativas en los otros tratamientos (Fig. 4C). Este resultado indica la alta influencia de las intensidades de irradiancia en la producción de flavonoides.

Ghasemzadeh y Ghasemzadeh (2011) observaron que las hojas de Zingiber officinale Roscoe presentaron un mayor contenido de flavonoides cuando fueron expuestas a la sombra. Los flavonoides son conocidos como sustancias protectoras contra el daño inducido por el exceso de luz y como antioxidantes (Jaakola et al., 2004; Nascimento et al., 2013).

beneficio del crecimiento de Piper aduncum

El crecimiento de Piper aduncum a 100% de irradiancia no fue beneficioso para la estimulación de estas defensas, o esta especie todavía presenta otros mecanismos de protección contra las altas irradiancias. Pacheco et al. (2013) observó en condiciones de pleno sol, un aumento de carotenoides. Por lo tanto, estos pigmentos pueden ser asociados con mecanismos de fotoprotección para esta especie. La actividad de la PAL aumentó en los tratamientos con 50% y 70% de irradiancia y mallas azules (Fig. 4D). la producción de fotoasimilados del metabolismo primario puede causar un aumento en las concentraciones de compuestos fenólicos a altas irradiancias (Warren et al., 2003). Sin embargo, cuando la luz, el agua y los nutrientes son suficientes; el crecimiento y la adaptación de la planta son priorizados. Por lo tanto, una alta cantidad de fenilalanina es utilizada para la síntesis de proteínas, y en consecuencia disminuye la producción de compuestos fenólicos.

La síntesis más baja de compuestos secundarios observada en las plantas cultivadas con 100% de irradiancia, está relacionada con la inducción de una tensión que fuerza su adaptación bajo estas condiciones. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar el aumento en la producción de metabolitos secundarios, debido a la disminución en la producción de metabolitos primarios a través de la fotosíntesis o la tensión inducida por las condiciones de irradiancia (Ghasemzadeh y Ghasemzadeh, 2011).

malla sombra azul
Usar malla sombra azul trae mas beneficios que usar una malla sombra roja.

Materiales y métodos

Localidad y material vegetal.

El experimento se realizó en la Universidad Federal de Lavras, Brasil. Las plántulas de Piper aduncum se produjeron en el Departamento de Biología, a partir de semillas. Las semillas fueron previamente germinadas en placas de Petri, en tres hojas de papel de filtro y se mantuvieron en una cámara de germinación de Mangelsdorf, a 25°C y durante un fotoperíodo de 12 horas, durante 30 días. Después de este período, las plántulas fueron transferidas a bandejas de polipropileno que contenían el sustrato comercial Tropstrato HA® (Vida Verde©, Brasil) y se mantuvieron en invernaderos con un 50% de sombreado hasta que alcanzaron los 2,5 cm de altura. Las plantas destinadas al cultivo a pleno sol (100% de irradiancia) se aclimataron previamente durante 7 días a 70% de irradiancia y luego durante 7 días a pleno sol antes de ser trasplantadas al sustrato definitivo.

localidad y clima

La irrigación se realizó diariamente y el suelo se mantuvo bajo la condición de capacidad de campo. Después de la aclimatación, las plántulas se trasplantaron a macetas de plástico, con una capacidad de 6 litros, que contenían un sustrato compuesto de subsuelo, arena y estiércol bovino, en proporción de 2: 1: 1, que se dispuso en los diferentes tratamientos de irradiancia. El experimento se realizó entre abril y julio de 2012, en la granja Gota da Esperança, perteneciente al Departamento de Agricultura, con las siguientes coordenadas geográficas: 21°14’07″S y 44°58’22″W, a 879 m de altitud. Las condiciones climáticas promedio observadas durante el experimento fueron proporcionadas por la Estación Climatológica del Departamento de Ingeniería Agrícola, tenían una temperatura máxima de 30.2°C y una mínima de 6.3°C, una precipitación de 1.28 mm y una humedad relativa de 72.7%.

piper aduncum
Se realizaron varios experimento en la universidad federal Lavras de brasil con la semilla de esta especie y obtuvieron varios resultados.

Luz ambiental alterada

Los tratamientos se caracterizaron por el cultivo de plantas durante 120 días, bajo cuatro luces ambientales alteradas, producidas por invernaderos de sombra con 70% y 50% de irradiancia natural incidente, dos mallas de sombreo de colores , en rojo (RN) y azul (BN), bloqueando el 50% de la radiación incidente y un tratamiento a pleno sol. Con la ayuda de un espectrorradiómetro portátil (USB650 Red Tide) acoplado a una fuente de radiación electromagnética DT-MINI (200 a 2000 nm) y una sonda reflectante R400-7-VIS-NIR (US BioSolutions Ocean Optics®), el espectro de radiación de diferentes ambientes fue evaluado, con una resolución espectral de 1 nm.

Las irradiancias normalizadas observadas en el tratamiento de 50% fueron 6.54 W/m², 13.08 W/m² en el tratamiento de 70%, 15.42 W/m² de 100%, 8.86 W/m² en BN y 9.07 W/m² en BN. Cada ambiente presentó los valores más altos en términos de cantidad y tamaño del espectro para la atmósfera con 100% de irradiancia, seguido de la atmósfera de la RN, en la que el valor encontrado fue de 70%, y 50% de irradiancia para el medio ambiente con BN. También se observó que la malla azul proporcionaba irradiancias, de aproximadamente 450-550 nm, y la malla roja entre 490 y 690 nm.

Análisis de crecimiento

El crecimiento se evaluó en veinte plantas de cada tratamiento y se tomaron como base las siguientes variables morfológicas: altura, diámetro del tallo, área foliar (LA), número de hojas, masa seca de la hoja (LDM), masa seca del tallo (SDM), masa seca de la raíz (RDM) y masa seca total (TDM).

También se calcularon los siguientes cocientes: raíz/partes aéreas (R/AP = RDM/ (LDM + TDM)), área foliar específica (SLA = LA/LDM), cociente del área foliar (LAR = LA/TDM), cociente del peso de la hoja (LWR = LDM/TDM) y cociente del peso de la raíz (RWR = RDM/TDM), utilizando ecuaciones de acuerdo con Benincasa (2003). La altura, el diámetro del tallo, el número de hojas y el área foliar se midieron en 15 días. La altura se midió con una escala graduada, una precisión de 1,0 mm y se midieron las distancias desde la superficie del suelo hasta la parte superior. El diámetro del tallo se midió con precisión con un calibre digital de 0,01 mm en la superficie del suelo.

Las variables masa seca de la hoja, masa seca del tallo, masa seca de la raíz y masa seca total se obtuvieron al final del período experimental (120 días). La masa seca se obtuvo al secar las hojas; El tallo y las raíces, previamente separados, se secaron en un horno de aire forzado, a 70°C, a peso constante.

hoja de matico
Tuvo un excelente crecimiento base a su desarrollo.

Metabolitos secundarios

Los compuestos secundarios se analizaron 150 días después del trasplante y se cuantificaron los contenidos de compuestos fenólicos totales, lignina y flavonoides. Además, también se verificó la actividad de la fenilalanina amoníaco-liasa (PAL). Se recolectaron dos hojas, completamente expandidas, ubicadas entre el segundo y tercer nudo de cinco plantas para cada tratamiento;

Los análisis de composición se realizaron por triplicado. Los contenidos de ácidos fenólicos totales y lignina se determinaron de acuerdo con Zieslin y Ben-Zaken (1993) con modificaciones. Para la extracción, los tejidos se trituraron con nitrógeno líquido y luego se liofilizaron durante seis horas. El material liofilizado se pesó (30 mg) y se transfirió a un tubo de 2-ml, se agregaron 1.5 ml de metanol al 80% y se mantuvo bajo agitación durante 15 horas a temperatura ambiente y en la oscuridad. El extracto se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min;

El sobrenadante se utilizó para la cuantificación de fenólicos totales y el precipitado para la extracción de lignina. Para la cuantificación de los ácidos fenólicos totales, 30 µL de reactivo de Folin-Ciocalteu se mezclaron con extracto de metanol (0,25 N) en una placa ELISA y se dejaron reposar durante 5 minutos. Luego, se agregaron 30 µL de carbonato sódico 1M y se homogeneizaron durante 10 minutos.

caracterización de Piper aduncum

Completó 160 µL de agua destilada, reposando durante 1 hora y se centrifugó a 2.250 x g durante 5 minutos. Luego, se recogieron 180 µL de esta mezcla y se depositaron en otra placa ELISA. Todo el procedimiento se realizó a temperatura ambiente. Las lecturas se realizaron a 725 nm. El contenido de ácidos fenólicos totales se calculó en función de la curva estándar de catecol y el valor se expresó en µg de catecol por gramo de materia seca. La lignina se extrajo del precipitado resuspendido en 1,5 ml de metanol al 80% y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó y el precipitado se secó a 65ºC durante cuatro horas. El precipitado seco se resuspendió en 1,5 ml de una solución 1:10 de ácido tioglicólico y ácido clorhídrico 2N y se homogeneizó en un baño de agua.

tiempo de lectura de Piper aduncum

Una vez más, el sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 1.5 ml de agua destilada y se sometió a centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió en 1,5 ml de hidróxido de sodio 0.5 M, se mantuvo bajo agitación durante 15 horas a temperatura ambiente y se sometió a centrifugación a 12,000g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 2-ml y se agregaron 200 µL de ácido clorhídrico concentrado; luego se mantuvo en hielo durante cuatro horas y se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 2 mL de hidróxido de sodio 0.5 M y se homogeneizó. Se recogieron 200 µL del extracto y se depositaron en una placa ELISA.

resultados de la lectura

Las lecturas se realizaron a 280 nm. El contenido de lignina se calculó basándose en la curva estándar de lignina y el valor se expresó en µg de lignina por gramo de materia seca. Los flavonoides totales se extrajeron de las hojas según un método adaptado de Santos y Blatt (1998). Aproximadamente 250 mg de materia seca se mantuvieron en metanol al 70% (v/v) durante 24 horas. Se transfirió una parte alícuota de 50 µl del sobrenadante a tubos de ensayo que contenían 1.8 ml de metanol al 70%. Se transfirió una parte alícuota de 50 µl del sobrenadante a tubos de ensayo que contenían 1.8 ml de metanol al 70%. Luego, se agregaron 130 µl de una solución de cloruro de aluminio (5g de cloruro de aluminio en 100 mL de metanol al 70%) y 6,7 ml de metanol al 70%, que se agitaron vigorosamente.

planta matico
El metabolismo secundario que tuvo la planta fue que se cuantificaron sus compuestos de fenolicos y flavonoides.

Análisis estadístico de Piper aduncum

El diseño experimental fue completamente aleatorio, en el que se utilizaron 20 réplicas por tratamiento para las evaluaciones de crecimiento y 5 réplicas para análisis bioquímicos. Los datos obtenidos durante un tiempo prolongado (cuantitativo) se analizaron mediante regresión polinomial (p ≤0.05), mientras que los datos cualitativos fueron sometidos a un análisis de la varianza, y las mediciones se compararon mediante la prueba de Tukey (p ≤0.05), utilizando el programa SAEG (SAEG-2007).

Tabla 1. Cociente de las raíces/partes aéreas (R/AP), área foliar específica (SLA), cociente del área foliar (LAR), cociente del peso de la hoja (LWR) y cociente del peso de la raíz (RWR) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes condiciones de irradiancia

tabla Tukey mallas rojas y mallas azules
Altura , diámetro del tallo , número de hojas (C) y área foliar de Piper aduncum

Fig 1. Altura (A), diámetro del tallo (B), número de hojas (C) y área foliar (D) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes irradiancias (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules – BN), a 120 DAT (días después del trasplante). Lavras, Brasil.

tabla Masa seca de hoja

Fig 2. Masa seca de hoja (LDM), masa seca del tallo (SDM), masa seca de la raíz (RDM) y masa seca total (TDM) de Piper aduncum cultivado bajo diferentes condiciones de irradiancia (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules –BN). Las medias seguidas por la misma letra en las columnas no difieren según la prueba de Tukey (p≤0.05). Lavras, Brasil.

tabla Ácidos fenólicos totales

Fig 3. . Ácidos fenólicos totales (A), lignina (B), flavonoides (C) y actividad de la PAL (D) en hojas de Piper aduncum L. cultivadas bajo diferentes condiciones de irradiancia (50, 70, 100% de irradiancia y mallas rojas – RN y mallas azules –BN). *Las medias seguidos por la misma letra en las columnas no difieren según la prueba de Tukey (p≤0.05) .Lavras, Brasil.

Conclusiones

El crecimiento y la síntesis de los compuestos secundarios (ácidos fenólicos totales, lignina y flavonoides) de Piper aduncum se vieron influenciados por las diferentes condiciones de irradiancia. Las plantas cultivadas bajo mallas de sombreo fotoselectivas azules presentaron un mayor crecimiento y producción de masa seca. La mayor cantidad de compuestos secundarios se obtuvo en las plantas cultivadas en mallas de sombreo azules. Por lo tanto, dado que es la especie productora con potencial comercial de compuestos bioactivos, se recomienda su cultivo en ambientes complementados con luz azul.

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